单细胞转录组还是火爆了五个年初，到如今的2024全球其实还是极端熟悉了它的模范数据分析念念路。都是先整合一皆的样品的抒发量矩阵后走降维聚类分群【RD-377】銈躲兓銈儭銉┿儐銈广儓 銈儫銇偄銈姐偝銇岀窢銇俱倞銇欍亷銇︺偣銈兂銇屼腑銇€︺偊銈姐儍锛併儰銉€銉兼棭銇忓彇銇ｃ仸銇囷綖2010-01-21銈儐銉婃槧鍍?&ATHENA119鍒嗛挓，然后第一档次降维聚类分群先在低分辨率的条件下对各个亚群进行生物学定名。如果是肿瘤界限的咱们频频是进行如下所示的分类：

immune (CD45+，PTPRC)，epithelial/cancer (EpCAM+，EPCAM)，stromal (CD10+，MME，fibro or CD31+，PECAM1，endo)

参考我五年前先容过的 CNS图表复现08—肿瘤单细胞数据第一次分群通用章程，这3大单细胞亚群组成了肿瘤免疫微环境的复杂。绝大部分著作都是收拢免疫细胞亚群进行细分，包括淋巴系（T，B，NK细胞）和髓系（单核，树突，巨噬，粒细胞）的两大类动作第二次细分亚群。但是也有不少著作是收拢stromal 里面的 fibro 和endo进行细分，何况诬捏生物学故事的。而且咱们还是积贮了心肝脾肺肾等多个器官的上皮细胞的细分亚群， 以及免疫细胞里面的髓系和B细胞细分亚群：

B细胞细分亚群髓系免疫细胞细分亚群

在针对各个细胞亚群进行细分的时候，全球也整理好了模范的分析条件，以2021的这个著作：《Single-cell RNA-Seq reveals transcriptional heterogeneity and immune subtypes associated with disease activity in human myasthenia gravis》为例，不错看到它里面的B细胞细分之后，不错进行愈加良好的亚群定名，参考：B细胞细分亚群，然后每个亚群有我方的特异性基因，特异性的生物学功能 ：

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模范的分析条件

因为这些细分亚群都是b细胞，是以原则上靠通路富集巧合候是不够形容各个亚群的特质的，尤其是在那些生物学布景敷衍不清的时候。比如如果咱们不绝细分上头的b细胞里面的plasma细胞，这个时候如果算法不绝给咱们多个不同亚群咱们就很难给出来生物学名字，而只是是按照编号来差异它们。咱们仍然是针对不同编号的亚群进行算法层面的特异性基因大要通路进行功能学形容，但是略显不够。是以如下所示，咱们加多了两个有挑战性的分析，便是拟时序和转录因子分析。

上头的案例，其实就回复了咱们今天推文的问题：为什么作念拟时序，因为它还是长短往往规而且的确是必备的单细胞分析条件，你很难跳往常。而且，加入拟时序分析巧合候如实是能愈加讲解问题。

有了互异分析还不够

既然咱们不错针对均一性相比好的亚群细化后的不同编号的亚群进行算法层面的特异性基因大要通路，那么为什么咱们还要作念拟时序呢，其实特异性基因靠的是互异分析，是不同细胞亚群奏凯的互异分析，它这个互异分析的单元是细胞亚群而不是具体的每个细胞自己。本体上咱们的单细胞转录组的优点应该是到单细胞分辨率，但是咱们绝大部分的分析其实是只是是到了细胞亚群的分辨率，两个细胞亚群之间详情是有各自的互异基因列表，但是因为这些细胞亚群是来自于一个均一性相比好的亚群是以 它们其实细化的时候很难有皆备的分界线，大要说它们之间就算是有分界线这个分界线亦然不错防碍的。

让咱们望望具体的案例，人所共知CD14和CD16是用于表征单核细胞（单核袪除细胞）亚型的两种常见符号物，CD14单核细胞主要参与炎症转换和免疫搪塞，而CD16单核细胞主要参与细胞毒性和抗体介导的免疫搪塞。而CD56和CD16这两种常用的名义符号物，用于差异NK细胞的亚型。咱们不错很容易通过互异分析取找到CD14和CD16的单核细胞的各自的特异性基因列表，大要CD56和CD16的NK细胞的各自的特异性基因列表。如下所示是一个案例，咱们这里是奏凯使用最粗浅的示范数据，来自于SeuratData包的ifnb数据集 ：

library(Seurat)library(SeuratData)# InstallData('ifnb.SeuratData')# 使用上头的代码下载SeuratData包的ifnb数据集，但长短常查考网罗。。。。# trying URL 'http://seurat.nygenome.org/src/contrib/ifnb.SeuratData_3.1.0.tar.gz'# Content type 'application/octet-stream' length 413266233 bytes (394.1 MB)# 如果网罗不行，就想办法下载(394.1 MB)保存在我方的电脑里面，然后底下的代码装置指定旅途的压缩包：# install.packages(pkgs = '~/database/seurat-data/ifnb.SeuratData_3.1.0.tar.gz'，#                  repos = NULL，#                  type = "source" )# 一定要看到这个包告捷装置哦# * DONE (ifnb.SeuratData)library(ifnb.SeuratData) data("ifnb")ifnbifnb=UpdateSeuratObject(ifnb)ifnbtable(ifnb$orig.ident) sce.all <- ifnb

有了上头的老练的数据集，接下来不错确认数据集自带的细胞亚群注目，从里面去挑选咱们想作念拟时序分析的单核细胞 （包括CD14和CD16的单核细胞）；

table(sce.all$seurat_annotations)sce.all$celltype = sce.all$seurat_annotationssel.clust = "celltype"scRNA <- SetIdent(sce.all， value = sel.clust)table(scRNA@active.ident) # 省俭筹划机资源scRNA = subset(scRNA，downsample=100) kp = scRNA$celltype %in% c('CD14 Mono' ， 'CD16 Mono')scRNA=scRNA[，kp]table(scRNA$celltype) 

关于CD14和CD16的单核细胞两个细胞亚群上头的组成的对象，咱们很容易作念互异分析

library(tidyverse)markers <- FindAllMarkers(scRNA， only.pos = TRUE， min.pct = 0.25， logfc.threshold = 0.25)all.markers =markers %>% dplyr::select(gene， everything()) %>% subset(p_val<0.05)dim(all.markers)table(all.markers$cluster)top10 =all.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10， wt = avg_log2FC) tmp=ScaleData(scRNA，top10$gene)DoHeatmap(tmp，features = top10$gene，raster = F)

不错看到的是CD14和CD16的单核细胞这两个细胞亚群如实是不错相比好的差异，但是它们也有交融的趋势，大要说有渐变的可能性，这个便是互异分析的细节问题。

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互异分析的细节

简粗浅单的互异分析天然是筹划出来具体的基因在不同细胞亚群的变化倍数，统计学料到打算即可。

而要展示互异分析的细节，就不可是以细胞亚群为单元，而需要具体到每个细胞自己，去望望具体的基因是如安在这两个单细胞亚群的具体的细胞之间迟缓的变化。

尝试一下monocle2的拟时序分析

拟时序有绝裁夺多种算法，背面咱们再迟缓先容，包括但不限于：

monocle2拟时序实战monocle3拟时序实战SCORPIUSSlingshot基于其它编程说话的拟时序分析

当今基于前边的CD14和CD16的单核细胞两个细胞亚群上头的组成的对象，咱们尝试一下monocle2的拟时序分析，最初是构建monocle2的对象；

seurat=scRNAlibrary(monocle) expr_matrix=seurat@assays$RNA$counts#使用counts抒发值sample_sheet<-seurat@meta.data#将推行信息赋值新变量gene_annotation=data.frame(gene_short_name=rownames(seurat))#构建一个含有基因名字的数据框rownames(gene_annotation)=rownames(seurat)#将上述数据框的行名赋值基因名字pd <- new("AnnotatedDataFrame"， data = sample_sheet)#将推行信息变量涟漪为monocel不错秉承的对象fd <- new("AnnotatedDataFrame"， data = gene_annotation)#将基因注目变量涟漪为monocle不错秉承的对象cds <- newCellDataSet(expr_matrix， phenoData = pd， featureData = fd，                      expressionFamily=negbinomial.size())#创建一个monocle的对象cds #cellData对象；monocle独到cds <- estimateSizeFactors(cds)cds <- estimateDispersions(cds) 

有了上头的monocle2的对象，拟时序只需要3个门径；

# 第一步: 挑选符合的基因. 有多个模范，# 举例提供已知的基因集，大要我方作念互异分析后拿到的统计学权贵的互异基因列表 diff_test_res <- differentialGeneTest(cds，                                      fullModelFormulaStr = " ~ celltype + orig.ident"，                                      reducedModelFormulaStr = " ~ orig.ident"，                                      relative_expr=TRUE， cores=4) ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res， qval < 0.01))ordering_genescds <- setOrderingFilter(cds， ordering_genes)plot_ordering_genes(cds) # 第二步: 降维。降维的目的是为了更好的展示数据。函数里提供了好多种模范，# 不同模范的终末展示的图都不太一样， 其中“DDRTree”是Monocle2使用的默许模范cds <- reduceDimension(cds，                        max_components = 2，                        num_dim = 6，                        reduction_method = 'DDRTree'，                        residualModelFormulaStr = "~orig.ident"， #去除样本影响                       verbose = F)# 第三步: 对细胞进行排序cds <- orderCells(cds)# 终末进行可视化plot_cell_trajectory(cds， color_by = "orig.ident")   +  plot_cell_trajectory(cds， color_by = "celltype")  

就不错看到，前边的CD14和CD16的单核细胞两个细胞亚群其实是起原于两个不相同品大要说两个分组，sle病东谈主的处理组和对照组。而前边的粗俗互异分析并莫得探究这个样品效应问题，但是咱们的拟时序探究到了，如下所示：

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粗俗互异分析并莫得探究这个样品效应问题

咱们不错很了了的看到，CD14的单核细胞其实是有两个人大不同的再细分的亚群，需要补充布景学问啦：

https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2019.01761/fullhttps://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2020.01070/full

那么拟时序到底是得到了什么样的效果呢，咱们不错不绝可视化另外两个要害的变量，便是拟时序分析后产生的  Pseudotime 和State ：

library(ggsci)p1=plot_cell_trajectory(cds， color_by = "celltype")  + scale_color_nejm() p1  p2=plot_cell_trajectory(cds， color_by = "Pseudotime")  p2 p3=plot_cell_trajectory(cds， color_by = "State")  + scale_color_npg()p3 library(patchwork)p1+p2/p3

不错看到，如果是拟时序的算法层面来说，是CD16的单核细胞迟缓演形成为了两种人大不同的CD14的单核细胞，如下所示：

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值得耀眼的是，这个演变的章程其实不错以为倒置过来的，因为算法推断其实没办法知谈发育章程，只是是有有一些基因考证拟时序在变化。咱们不错有好多进一步的分析的可能性，就需要熟练的掌执拟时序分析后针对每个细胞 产生的  Pseudotime数值和State分组 ，如下所示 ：

> colnames(pData(cds))[1] "orig.ident"         "nCount_RNA"         "nFeature_RNA"       "stim"              [5] "seurat_annotations" "celltype"           "Size_Factor"        "Pseudotime"        [9] "State"             > head(pData(cds))                  orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA stim seurat_annotations  celltypeAAAGGCCTAAACGA.1 IMMUNE_CTRL       2675          792 CTRL          CD16 Mono CD16 MonoAAATACTGGTTCTT.1 IMMUNE_CTRL       2922          830 CTRL          CD14 Mono CD14 MonoAAATCCCTGTTGAC.1 IMMUNE_CTRL       2139          640 CTRL          CD14 Mono CD14 MonoAAATTGACAAACAG.1 IMMUNE_CTRL       1854          716 CTRL          CD14 Mono CD14 MonoAACTCTTGCATTCT.1 IMMUNE_CTRL       2219          764 CTRL          CD16 Mono CD16 MonoAAGACAGAGTTAGC.1 IMMUNE_CTRL       1760          619 CTRL          CD14 Mono CD14 Mono                 Size_Factor Pseudotime StateAAAGGCCTAAACGA.1   1.0390142  5.7395392     1AAATACTGGTTCTT.1   1.1349531 10.9696635     3AAATCCCTGTTGAC.1   0.8308230  7.6699632     1AAATTGACAAACAG.1   0.7201243 10.8909299     3AACTCTTGCATTCT.1   0.8618963  0.1031971     1AAGACAGAGTTAGC.1   0.6836131 10.5724209     2> table(pData(cds)$State)  1   2   3 105  49  46 

而且也不错把这个拟时序分析后针对每个细胞 产生的  Pseudotime数值和State分组  对象回帖到成例的Seurat的降维聚类分群历程里面去可视化，粗浅的代码如下所示：

sce <- SCTransform(scRNA，verbose = F)  sce <- RunPCA(sce，verbose = F)  sce <- RunUMAP(sce， dims = 1:20)DimPlot(sce，group.by = 'celltype')sce$State = pData(cds)$Statesce$Pseudotime = pData(cds)$PseudotimeDimPlot(sce，group.by = 'State') +   DimPlot(sce，group.by = 'celltype') +  DimPlot(sce，group.by = 'orig.ident') 

不错看到，在二维平面上头，CD14和CD16的单核细胞两个细胞亚群的互异其实是跟两个不相同品大要说两个分组并存的，而且是在每个样品里面都很了了的不错看到是CD16的单核细胞迟缓演形成为了两种人大不同的CD14的单核细胞。

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是CD16的单核细胞迟缓演形成为了两种人大不同的CD14的单核细胞

这个具体的变化过程，就不错不绝两两之间作念拟时序看基因列表了，绘画渐变的热图。

撸撸网拟时序其实也不够

天然上头的案例讲解了拟时序分析是成例互异分析的很好的补充，把分辨率从细胞亚群为单元提升到了具体的单个细胞自己，因为每个细胞都有我方的惟一的  Pseudotime数值，确认这个数值就不错对细胞进行排序啦。但是这个算法自己亦然不够的，它得到的  Pseudotime数值是大小的排序是不错反过来的，这个时候需要一些先验学问的扶助，比如某些基因是已知的的章程变化趋势。又大要需要一些其它算法的扶助，比如 使用cytoTRACE评估不同单细胞亚群的分化潜能。

天然了，如果潇洒抒发量矩阵自己，引入全新信息，比如具体的基因的转录本的未剪接和剪接 mRNA数值，就不错构建RNA 速度模子作念分析，得到的发育章程就有宗旨而且可靠啦，详见：10x官网下载pbmc3k数据集走RNA速度高下流分析实战。但是它也有污点，最初是需要对测序的fastq文献重新分析，能力获取到未剪接和剪接 mRNA数值，其次在传统的基于二代测序数据的10x单细胞转录组其实只是是测了具体的每个mRNA的两头二选一良友，并莫得把两个mRNA测通是以就很难赢得准确的未剪接和剪接 mRNA数值。

天然了，算法会一直有更新，全新的软件和器具也会被持续不断的缔造出来，迟缓的就措置了以前的问题。比如2024新发表的scVelo，就不再依赖于剪接信息，而是通过引入基因调控数据 ，提供更准确的细胞轨迹信息和伪时候推断效果。详见

著作：TFvelo: gene regulation inspired RNA velocity estimation. Nat Commungithub官网（Python软件）：https://github.com/xiaoyeye/TFvelo你当今看到的是拟时序一册通专辑

今天咱们分享了为什么作念拟时序，把它简化成为了主淌若为了展示互异细节这个功能，忽略了它在发育学层面的诓骗，因为我不是发育生物学界限布景。天然说拟时序分析在单细胞转录组数据分析中具有流毒意旨，不错匡助咱们领会细胞情景的动态变化和发展轨迹，以及疾病的发展过程和颐养机制，主淌若有底下的这些诓骗，需要鸠合具体的文献来解读：

识别细胞情景的动态变化： 单细胞转录组数据频频是通过拿获无数单个细胞的基因抒发数据来获取样品中细胞的各样性。拟时序分析不错匡助咱们领会细胞在不同工夫点或条件下的动态变化，识别细胞情景的更正过程，比如细胞分化、激活、增殖等。复原发育轨迹： 拟时序分析不错匡助复原细胞发育轨迹，揭示细胞从干细胞到闇练细胞的分化过程。通过构建细胞的发育轨迹图，不错将细胞按照它们在发育过程中的相似性进行聚类，进而酌量发育过程中的要害更正和调控因子。酌量疾病施展过程： 在疾病酌量中，拟时序分析不错匡助咱们领会疾病的发展过程，识别疾病规划的细胞亚型或情景的动态变化，以及发病机制的要害节点。这关于疾病会诊、展望和颐养具有流毒意旨。探索细胞在特定条件下的反应机制： 拟时序分析不错匡助咱们酌量细胞在不同环境或刺激条件下的反应机制。通过相比不同工夫点或条件下的细胞抒发格式，不错识别出反应于特定刺激的基因抒发变化，并揭示其潜在的调控网罗和信号通路。

值得一提的是拟时序一册通专辑的目次是：

为什么作念拟时序（展示互异细节）拟时序的正确姿势，造作示范，翻新式拟时序拟时序的多种算法大比拼monocle2拟时序实战降维聚类分群拟时序多种基础可视化正向特等可视化（宗旨基因抒发量，基因集打分）反宗旨特等可视化（5种可视化）monocle3拟时序实战SCORPIUS实战Slingshot实战基于其它编程说话的拟时序分析

可是，本东谈主的领会详情是单方面的，但愿通过这10个推文的开采能让全球对单细胞转录组的明星分析模范拟时序有一个基础的露出。也接待全球冷落来我方的不同的主张，大要我方对拟时序的疑心之处，接待留言参与商量哦！

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